實(shí)時熒光定量PCR儀（Real-timePCR，也叫qPCR，QuantitativePCR）是一種用于定量分析DNA或RNA樣品中目標(biāo)序列的方法。與傳統(tǒng)的PCR（聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)）不同，實(shí)時PCR在PCR反應(yīng)過程中實(shí)時監(jiān)測熒光信號的變化，通過熒光信號的強(qiáng)度來實(shí)時定量目標(biāo)基因的擴(kuò)增量。其操作原理主要涉及以下幾個方面：
1.PCR基本原理
PCR是利用熱穩(wěn)定DNA聚合酶在不同溫度下反復(fù)擴(kuò)增特定DNA序列的過程，包含以下幾個基本步驟：
變性（Denaturation）：將DNA模板加熱到高溫（一般為94-98°C），使DNA雙鏈分開，得到單鏈DNA。
退火（Annealing）：溫度降低（一般為50-65°C），使引物與單鏈DNA模板互補(bǔ)結(jié)合。
延伸（Extension）：溫度提高至聚合酶最適工作溫度（一般為72°C），聚合酶在引物的幫助下將游離的dNTP（脫氧核糖核苷三磷酸）加到DNA模板上，擴(kuò)增出新的DNA鏈。
2.實(shí)時PCR與傳統(tǒng)PCR的不同
傳統(tǒng)PCR僅在反應(yīng)結(jié)束后，通過凝膠電泳檢測擴(kuò)增產(chǎn)物的量。而實(shí)時PCR則在擴(kuò)增的每一個循環(huán)中，通過熒光信號的變化來實(shí)時監(jiān)控?cái)U(kuò)增的過程。實(shí)時熒光PCR具有高靈敏度和高特異性，能夠定量分析基因的表達(dá)量、突變、拷貝數(shù)等。
3.熒光信號的監(jiān)測
實(shí)時PCR通過熒光染料或探針的熒光信號來監(jiān)控DNA擴(kuò)增的過程。熒光信號與擴(kuò)增產(chǎn)物的量成正比，隨著PCR反應(yīng)的進(jìn)行，熒光信號逐漸增加。
熒光信號監(jiān)測的兩種主要方式：
SYBRGreen染料法：SYBRGreen是一種熒光染料，它能特異性地結(jié)合到雙鏈DNA上。當(dāng)SYBRGreen與雙鏈DNA結(jié)合時，會發(fā)出熒光。每擴(kuò)增一個DNA片段，熒光強(qiáng)度就增加。
探針法（TaqMan探針法）：使用特定的熒光標(biāo)記探針進(jìn)行擴(kuò)增檢測，探針通常由一個熒光染料和一個猝滅劑組成，只有在探針被聚合酶的5'→3'外切酶活性水解時，熒光染料才會被激發(fā)并釋放出信號，從而實(shí)現(xiàn)定量。
4.實(shí)時PCR的操作原理
實(shí)時熒光定量PCR的基本操作原理是監(jiān)測熒光信號隨著PCR擴(kuò)增過程中的變化來定量DNA或RNA的濃度。具體原理如下：
循環(huán)數(shù)與熒光信號：隨著PCR反應(yīng)進(jìn)行，每一輪擴(kuò)增都會增加目標(biāo)DNA的數(shù)量。熒光信號的強(qiáng)度與擴(kuò)增產(chǎn)物的量成正比。在早期擴(kuò)增階段，熒光信號較弱，但隨著擴(kuò)增產(chǎn)物的增加，熒光信號逐漸增強(qiáng)。
閾值循環(huán)數(shù)（Ct值）：在PCR反應(yīng)中，熒光信號會在某一時刻超過設(shè)定的閾值（Threshold），此時的循環(huán)數(shù)即為Ct值（Cyclethreshold）。Ct值越小，表示目標(biāo)基因的初始量越多；Ct值越大，表示初始量越少。
5.定量分析過程
標(biāo)準(zhǔn)曲線法：通過構(gòu)建已知濃度的標(biāo)準(zhǔn)樣本的標(biāo)準(zhǔn)曲線，可以將未知樣本的Ct值與標(biāo)準(zhǔn)曲線進(jìn)行比對，從而得到目標(biāo)基因的初始濃度。
ΔCt法：通過測量目標(biāo)基因和內(nèi)參基因的Ct值差異（ΔCt），進(jìn)而比較不同樣本中目標(biāo)基因的相對表達(dá)水平。
ΔΔCt法：通過計(jì)算不同實(shí)驗(yàn)組之間的ΔCt差異（ΔΔCt），來分析目標(biāo)基因在不同條件下的表達(dá)變化。
6.實(shí)時PCR儀的構(gòu)成與工作流程
實(shí)時熒光定量PCR儀一般由以下部分組成：
熱循環(huán)模塊：用于加熱和冷卻樣本，使其在各個溫度階段進(jìn)行變性、退火、延伸等反應(yīng)。
熒光檢測模塊：檢測PCR反應(yīng)中產(chǎn)生的熒光信號，實(shí)時監(jiān)測擴(kuò)增過程中的熒光變化。
數(shù)據(jù)分析軟件：通過分析熒光數(shù)據(jù)，自動計(jì)算出Ct值，并進(jìn)行數(shù)據(jù)處理和結(jié)果輸出。
操作流程：
樣本準(zhǔn)備：將DNA或RNA模板、引物、熒光染料（或探針）、酶和緩沖液等混合，準(zhǔn)備PCR反應(yīng)體系。
加入反應(yīng)板：將反應(yīng)體系加入96孔板或其他適用的反應(yīng)板中，并在PCR儀中放置好。
啟動反應(yīng)：設(shè)置合適的溫度循環(huán)程序，啟動實(shí)時PCR反應(yīng)。
數(shù)據(jù)采集：在每個擴(kuò)增循環(huán)結(jié)束時，PCR儀會自動記錄熒光信號，并生成實(shí)時熒光數(shù)據(jù)。
分析結(jié)果：根據(jù)熒光數(shù)據(jù)計(jì)算Ct值，并進(jìn)行相應(yīng)的定量分析。
7.總結(jié)
實(shí)時熒光定量PCR儀利用熒光信號監(jiān)測DNA擴(kuò)增的過程，通過熒光信號的強(qiáng)度反映PCR產(chǎn)物的量，進(jìn)而實(shí)現(xiàn)對目標(biāo)基因的定量分析。其高靈敏度和高特異性使其成為基因表達(dá)分析、病原檢測、基因組研究等領(lǐng)域的重要工具。
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